方法
- テストシステム: プールされた肝臓ミクロソームと、必須補因子を満たした組み換え個別発現のヒト酵素
- CYPアイソフォーム: CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、 CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6 および CYP3A4 (他のCYP、UGTおよび薬物代謝酵素も用意できます)。
- 確証にはアイソフォーム特定の化学阻害剤と組み換え酵素が使用されます。
被試験体はリン酸塩緩衝液内のミクロソームを使用して、最短でも5分間予備培養されます。被試験体の代謝は、NADPHもしくは他の補因子によって開始されます。有機溶剤を足すことで培養が終結し、液体クロマトグラフィー(LC-MS)を使用して被試験体の、または代謝物質のサンプルが分析されます。
フェーズ Ⅰ - In vitro培養状態のオプティマイゼーション
被試験体はミクロソームの濃度(一般に 1 mL あたり0.1 - 1 mgのタンパク質)によって最長60分間、4つの時点に分けて、NADPHおよびその他の適切な補因子が存在する中で三重に培養されます。
コントロール培養は補因子が存在しない状態で実行されます。ミクロソーム濃度の培養状態と、被試験体の消滅が起きる現象が線上になる時点、これらが追跡実験を決定する目安となります。
フェーズ Ⅱ - 被試験体代謝の薬物動態解析
最適化された条件のもとで三重に試験される8種類以上の濃度のサンプル培養で、どのくらいの速度で被試験体が消滅するかがが観察されます。データはミカエリス・メンテンの双曲線フィッティングによって分析され、動力的パラメーター KmおよびV最大値が被試験体のために決定されます。
フェーズ Ⅲ - CYP固有の化学阻害剤による阻害分析
被験物質はプールされ、酵素選択的な化学阻害剤の存在しないヒト肝ミクロソームを使って濃度 <K で 3 重に培養されます。コントロール培養は、媒体溶液のみを使用した阻害剤のない状態で実行されます。
フェーズ Ⅳ - 組み換えヒトCYPを使った代謝
被験物質は濃度 <Km によって 3 重に培養され、その範囲は組み換えヒト CYP、UGT、また他の DME(上記参照)となっています。被試験体の相対的な濃度は0分と60分に測定されます。
成果物
これらのアッセイが、In vitroで被試験体の代謝の程度を決定する酵素を判別します。被試験体消滅の動態、また代謝物の形成が測定されます。In vitro 代謝評価は関与する主要な酵素を判別し、ファーストインヒューマン試験の前に、潜在的な in vivo クリアランス構造障害について注意を促します。